题目：Ubiquitylation Dynamics of the Clock Cell Proteome and TIMELESS during a Circadian Cycle
泛素化修饰组学研究昼夜节律调控机制
期刊：Cell Reports
影响因子：8.032
主要技术：泛素化修饰组学
研究背景
昼夜节律机制帮助生物个体调整其生理功能以适应外界环境的变化。早期的机制研究多集中在转录调控机制基础之上，随着研究的深入，蛋白水平调控，特别是各种翻译后修饰，如泛素化，对昼夜节律的调控同样起到了重要作用。
研究结果
1. 泛素化蛋白质组学鉴定昼夜节律相关蛋白
作者利用基于泛素化修饰蛋白质组学的方法，对处于不同时间节点的果蝇头部样本进行泛素化label free质谱检测分析，每组样本包含三个生物学重复。果蝇头部提取物中的时钟蛋白质主要来源于视网膜，视网膜具有自己的时钟基因，而恒定黑暗中的运动活动节律很大程度上取决于脑时钟网络的小侧腹神经元（sLNv）振荡器。因此，作者将tim + clock细胞的泛素化组学数据与胚胎神经细胞和成人光感受器的两个泛素化组学数据集进行了比较，发现在光感受器和时钟细胞中同时存在91种泛素化蛋白（图 1D）。在不同的时间节点之间的泛素化修饰的差异蛋白有52个（图1E），在这些差异蛋白中，一个核孔复合物蛋白MTOR的丰度变化随着时间的变化尤其显著（图1F）。一般情况下泛素化蛋白丰度的倍数变化集中在2倍以下（图 1G），这与哺乳动物肝脏中总蛋白水平的昼夜节律相似。作者对52个候选蛋白进行分析，发现泛素化蛋白质不均匀相分布，大多数在CT6达到峰值（n = 43）。因此，作者认为，时钟细胞中的蛋白质泛素化集中在白天，而昼夜节律控制的蛋白质合成主要集中于CT7（中午）和CT19（午夜），以双峰方式呈现。
图1 泛素化蛋白质组学鉴定昼夜节律相关蛋白
2. MTOR蛋白节律泛素化
为了验证组学结果，作者选择了几个候选蛋白进行WB验证实验。结果表明，有四个候选蛋白（HSP83，NRV2，MTOR和SGG）显示出可识别的泛素化，但是只有纯化的bioUb样品的MTOR免疫印迹结果表现出泛素化节律性（图 2A和2B）。为了控制总蛋白水平的可能节律性，作者选择抗MTOR印迹果蝇头部裂解物，发现蛋白质水平没有明显变化（图 2C），这表明MTOR的泛素化程度是受到调控的。MTOR是与NUP153形成核篮的最内核孔蛋白，它参与细胞分裂的控制并在染色质调节中发挥作用。
为了研究这种调控对节律的影响，作者利用RNAi的技术敲除MTOR，发现敲除导致行为周期延长并降低节律性的幅度（图2D）。
图2 MTOR的节奏泛素化
3. MTOR的泛素化影响昼夜节律的分子机制
MTOR作为核孔蛋白促使作者研究了Mtor RNAi蝇的sLNv中PER、TIM的亚细胞定位和在不同时间节点的蛋白水平，来探究其影响昼夜节律的分子机制。PER和TIM通常从CT18开始经历由精细调节的细胞质到核的转变，以实现它们作为转录抑制因子的作用。与野生型相比，TIM和PER在Mtor RNAi sLNvs的两个时间点显示出更多的细胞质定位（图3），表明这些蛋白质的核定位缺陷可能导致行为期延长。午夜时分，TIM和PER的表达水平有非常显著的提升，早上TIM和PER的降解速度也变慢。综上表明，MTOR通过影响下游TIM及PER蛋白的定位及泛素化水平，进而控制果蝇节律。
图3 PER和TIM亚细胞定位
图4 MTOR的泛素化影响昼夜节律的分子机制
研究小结
作者认为，除控制节律性蛋白质降解外，昼夜节律调节的泛素化可能会引导蛋白质功能的震荡变化，如果蝇中核孔复合体蛋白MTOR受到周期性泛素化的调控，影响其蛋白表达量，并且在昼夜节律分子振荡器的反馈系统中发挥重要作用。
解析文献
Áron Szabó, Christian Papin,et al. Ubiquitylation Dynamics of the Clock Cell Proteome and TIMELESS during a Circadian Cycle. Cell Reports, 2018 , 23 (8) :2273-2282.
参考文献
1. Low, T.Y., Magliozzi, R., Guardavaccaro, D., and Heck, A.J. Unraveling the ubiquitin-regulated signaling networks by mass spectrometry-based proteomics.Proteomics, 2013,13, 526–537.
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