动物组织/细胞RNA提取试剂盒(含DNase I)

中文名称：动物组织/细胞RNA提取试剂盒(含DNase I)
英文名称：RNAtiqu Tissue&Cell RNA Extraction Kit(DNase I)
产品规格：50次
本试剂盒将高效的异硫酸胍裂解技术与硅基质膜纯化技术相结合，可从动物细胞及组织中高效提取总RNA。起始样本一般最多30 mg组织或1x107细胞。本试剂盒还可回收未完全纯化的RNA、体外转录和酶促反应后得到的RNA。用本试剂盒可提取纯化分子量大于200碱基的高品质RNA，几乎无DNA残留。如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验，残留的DNA可利用无RNase的DNase在柱上进行消化去除。提取的RNA可用于RT-PCR、 Nothern Blot、Dot Blot等下游实验。

试剂盒组成：

保存条件：DNase I及10×Reaction Buffer -20℃保存，其它组分室温(15～30℃)。

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇(新开封或提取RNA专用)。

实验前准备及重要注意事项：
1、预防RNase污染，应注意以下几方面：
1)使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2)配制溶液应使用无RNase的水。
3)操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2、提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取的量和质量。
3、Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇，1ml Buffer RL加10μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL室温可保存1个月。
4、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
5、Buffer RL如果产生沉淀，可于56℃加热使其溶解后室温放置。
6、所有离心步骤均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

操作步骤：
1、样品处理
① 组织：将组织在液氮中磨碎。每20-30 mg组织加600μl Buffer RL(使用前检查是否加入β-巯基乙醇)，组织样本少于20 mg加350μl Buffer RL。样品体积不超过Buffer RL体积的十分之一。
② 单层培养细胞：将细胞在培养瓶中直接裂解或处理成细胞悬液，离心得到细胞沉淀，弃上清，每6-10cm2培养面积加入600μl Buffer RL，小于6cm2加入350μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。
③ 细胞悬液：12000rpm(～～13400×g)离心1分钟弃上清，得到细胞沉淀。每5×106-1×107细胞加入600μl Buffer RL，少于5×106细胞加入350μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。
注意：
① 尽量除尽细胞培养基，细胞培养基可能抑制细胞的裂解影响RNA产量。
② 尽量使细胞充分悬浮并充分裂解，否则影响RNA产量。
2、样品充分裂解后，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
3、12000rpm离心2-5min，取上清进行以下操作。
4、向步骤3中得到的溶液中加入1倍体积(600μl 或350μl)的70%乙醇(无RNase水配制)，混匀。
注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，不会影响后续实验。
5、将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12000rpm离心1分钟，弃废液。将吸附柱放回收集管中。
注意：吸附柱的最大载量为100μg，不要超载，否则会影响RNA的产量和纯度。
6、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、配制DNase I 混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl)，混匀， 配制成终体积为80μl的反应液。
8、向吸附柱中直接加入80μl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分钟。
9、向吸附柱中加入200μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇), 12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
11、重复步骤10。
12、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
13、将吸附柱转入新的离心管中，向吸附膜中间位置加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：
① RNase-Free Wate体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。
② 如果要提高RNA的产量，可用30-50μl新的RNase-Free Water重复步骤13。
③ 如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤13。

储存条件：室温(15～30℃)。 

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！