产品信息

产品描述

病毒DNA复制是病毒增殖的一个重要表现，采用EdU方法可以快速检测病毒DNA的复制活性，并掌握病毒增殖的位点。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，因分子量小可在动物体内能够迅速扩散到各种组织和器官中，并渗入正在复制的DNA分子，通过基于YF荧光染料与EdU的特异性反应即可简单、快速、准确地检测出病毒DNA的复制活性。

试剂盒中EdU试剂含有炔烃，而Yefluor 594 Azide染料试剂含有叠氮化合物。点击法的EdU标记快速有效，无需DNA变性，抗原抗体反应等步骤，实验周期短，效果显著，易于使用。

光谱特性：Yefluor 594 Azide: Ex/Em=594/617 nm；Hoechst 33342：Ex/Em=350/461 nm，bound to DNA。

产品组分

规格：上述反应次数是针对96孔板培养的细胞。

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。-20℃避光保存，有效期1年。

注意事项

操作时请采取防护措施，穿防护服、戴一次性手套等。

使用方法

1、EdU标记

注意：EdU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择，推荐客户以10 μM的EdU初始浓度进行摸索。细胞培养基、细胞生长密度及细胞类型和其他实验条件都有可能影响细胞的标记效果。预实验中，我们建议客户设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳的合适您的细胞的实验浓度。

1.1 按每孔4×10³-1×10⁵细胞接种于96孔板中，进行您所需要的药物处理或者其他刺激处理。

1.2 准备一份2×的EdU工作液（组分A）：以完全培养基稀释10 mM的储液至合适的工作浓度。建议您以10μM的初始工作浓度开始预实验。

1.3 预热2×的EdU工作液，加入等体积的培养基，使浓度变为1× (如：需要得到10 μM的终浓度，应以新鲜培养基等体积加入到20 μM的EdU工作液中)。

1.4 合适时间合适条件孵育细胞，EdU孵育细胞的时间可以直接用作测定细胞DNA合成的指标，时间点选择以及孵育时间的长度取决于细胞生长速率。通过短暂的EdU孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。

2、细胞固定及促渗操作

注意：本参考步骤是针对以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促渗操作样本而优化的操作方法，但本参考所介绍的步骤同样可用于其他类似操作的样本，如以甲醇固定以皂苷固定的样本等。

2.1 孵育完成后，去除培养基加入50 μL 4%中性多聚甲醛至各个孔，室温孵育15-30 min后，去除固定液。

2.2 每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室温孵育5 min，中和残留的固定液。

2.3 以每孔0.1 mL 3% BSA in PBS的洗涤液洗涤细胞2次。

2.4 去除洗涤液，加入0.1 mL 0.5% Triton X-100 in PBS到每个孔中，室温孵育20 min。

3、EdU检测

注意：本参考步骤每个孔反应使用100 μL的Click-iT反应混合物。用户可根据自己样本情况调整等比例减少所用的溶液体积。

3.1 准备1× Click-iT EdU 反应缓冲液（组分C）：将10× 组分C试剂以去离子水稀释10倍即可。

3.2 制备一份5× 的Click-iT EdU反应添加物储液（组分E）：加0.3 mL去离子水至30 mg的E组分试管中（100 mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用（注意：不同规格的组分E均按照此比例加去离子水溶解为5× 储液备用）。

3.3 准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物：以去离子水稀释5× 储液（组分E）至1×，溶液现用现配，当天用完。

3.4 依据表1 准备Click-iT反应混合物。表1.要求添加的组分对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。

表1 Click-iT反应混合物